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Cómo se preparar una muestra para observar en el microscopio

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Para realizar una buena observación con el microscopio, una parte fundamental es la preparación de la muestra. Tener una noción sobre la manipulación de las muestras, hará que tus observaciones sean más buenas y obtengas mejores resultados.

En líneas generales, las muestras se posan sobre portaobjetos o diapositivas, que son trozas de vidrio o plástico transparente que permiten el paso de la luz a la vez que mantienen la muestra en suspensión.

Hay varios tipos de microscopios y además varios tipos de pruebas, por lo que hay más de una manera de preparar las muestras para su observación. El método que se utiliza para preparar el portaobjeto dependerá de la naturaleza de la muestra, siendo tres, en grandes rasgos, los métodos o técnicas más utilizadas: los montajes húmedos, los montajes secos y los tintados.

¿Qué material se necesita para preparar una muestra?

Para empezar, hay que preparar todo el material necesario que, además de los ya nombrados portaobjetos, hay que incluir los cubreobjetos, pinzas, pipeta, tinte y papel absorbente. Dependiendo de la muestra usaremos unos u otros materiales.

Portaobjetos

El portaobjetos es el soporte para la muestra, suele ser de vidrio y tiene aproximadamente, unas dimensiones de 76 x 26 mm y entre 1 y 1.5 milímetros de espesor.

Hay que tener cuidado al manipular el portaobjetos, ya que al ser un vidrio fino puede producir cortes. Hay que vigilar también de que no se nos rompa cuando trabajamos con él, ya que correremos el riesgo de clavarnos algún fragmento.

Existen varios tipos de portaobjetos. Los más comunes son totalmente planos por ambas caras. Estos portaobjetos son adecuados en la gran mayoría de prácticas. Para muestras más líquidas o que no requieran de cubreobjetos, también existen portaobjetos con una cavidad cóncava llamados portaobjetos excavados.

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Cubreobjetos

El cubreobjetos es una pieza de vidrio cuadrada (más pequeña que el portaobjetos), con unas dimensiones de entre 18 y 20 milímetros y un espesor de entre 0.13 y 0.17 mm.

Al ser un vidrio tan fino, hay que extremar las precauciones al manipularlo ya que es muy frágil.

La función del cubreobjetos es fijar la muestra en el portaobjetos y protegerla de posibles agentes contaminaciones. Además, es también una medida de protección para el microscopio, al evitar que la lente del objetivo toque la muestra.

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Pinzas

Las pinzas nos proporcionarán coger o manipular muestras solidas sin contaminarlas ni entrar en contacto con ellas. Las hay de muchas formas y tamaños, en muchos casos están incluidas en los packs de portaobjetos o de microscopios.

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Pipeta

La pipeta se utiliza para coger muestras líquidas y colocarlas en el portaobjetos. También se utiliza para colocar sobre la muestra la cantidad de líquido adecuada para su hidratación.

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Pasos para preparar una muestra en el microscopio

Las muestras húmedas suelen ser ejemplares vivos, fluidos transparentes y muestras acuáticas. La preparación de una muestra húmeda es similar a un sándwich. La capa base es el portaobjeto, seguido del fluido a observar y en la parte superior se coloca un pequeño cuadrado de vidrio o plástico transparente (llamado cubreobjetos), que tiene la función de limitar la disipación del fluido y proteger el objetivo del microscopio.

El procedimiento para preparar una muestras húmeda en un portaobjetos sería:

1.- Con un portaobjetos limpio y seco, se coloca un gota de fluido en el centro (agua, aceite, glicerina, o directamente la muestra líquida).

2.- Si la muestra a observar no es líquida, la introduciremos en el fluido con la ayuda de unas pinzas.

3.- Cogeremos el cubreobjetos, con cuidado de no ensuciarlo o llenarlo de huellas, y lo pondremos en un ángulo en el que un extremo toque el portaobjetos y la muestra nos quede debajo.

4.- Bajar gradualmente el cubreobjetos, evitando la generación de burbujas de aire, ya que estas dificultarían la observación. La mayoría de los problemas con las burbujas de aire se originan por no colocar bien el cubreobjetos, por no entrar en contacto con la gota de líquido, o por utilizar un líquido muy viscoso (espeso). En caso de que la gota de líquido sea excesivamente grande, el cubreobjetos se deslizará sobre el portaobjetos, dificultando el enfoque de la muestra en el microscopio. Una solución es secar el exceso con un paño/papel o repetir el proceso con menos líquido.

5.- Una vez realizado este proceso, colocamos el portaobjetos en la platina del microscopio y empezamos a mirar a través de él empezando por los objetivos de menor aumento, para tener una vista general.

Algunos consejos adicionales podrían ser:

Algunos microorganismos (como el Paramecio) necesitan más espacio que el que dejan el portaobjetos y el cubreobjetos para moverse. Incluyendo unos hilos de algodón (o similares), en los bordes del cubreobjetos, para que sirvan de apoyo, pueden solucionar el problema de falta de espacio. Otra solución es utilizar trozos de cubreobjetos que se nos hayan roto. En cualquier caso presiona un poco para asegurar que no queda aire de por medio.

A medida que el fluido se disipa o evapora en los bordes del portaobjetos, los ejemplares vivos pueden morir. Un método para impedir que la muestra se seque, es aplicar vaselina con un palillo en el borde de la muestra antes de dejar caer el cubreobjetos. Luego, presiona suavemente sobre el cubreobjetos para eliminar las bolsas de aire y sellar el portaobjetos.

Preparación húmeda: Muestras líquidas, espesas u opacas

Hay ocasiones en el que las muestras líquidas son muy espesas, tienen colores vivos que dificultan la observación o son opacas (Por ejemplo la sangre, el semen, etc.). En estos casos se puede realizar un preparado un poco especial o truco que consiste en:

1.- Colocar una gota de muestra en un portaobjetos.

2.- Con un segundo portaobjetos limpio, se sostiene en ángulo sobre el primer portaobjetos con la gota hasta tocarla. Por acción capilar, parte de la muestra será atraída por el segundo portaobjetos. Vuelve a separar los portaobjetos girando el segundo, y verás cómo una pequeña parte de la muestra se a difuminado en él.

3.- Deja secar la muestra o cúbrela con un cubreobjetos.

De esta manera podrás distinguir mejor las células y te quedará una muestra más delgada y translúcida.

Preparación de muestras secas

Para preparar una muestra en seco, el procedimiento puede ser tan simple cómo colocar la muestra directamente en la platina del microscopio, si la muestra es grande y lo permite. Este procedimiento, es el más habitual con los microscopios estereoscópicos.

Ten mucho cuidado cuando bajes la lente del objetivo para no tocar la muestra

Si la muestra es pequeña y/o fina, se puede proceder con el método sándwich, parecido al preparado de muestras húmedas, con el portaobjetos y el cubreobjetos. Con los microscopios compuestos este suele ser el método que más se utiliza.

Otro procedimiento que se puede emplear con muestras resbaladizas o que no se puedan cubrir con el cubreobjetos, es aplicar esmalte de uñas transparente al portaobjetos y colocar la muestra antes de que se seque. Este método fijara la muestra y también hace que el portaobjetos sea semipermanente. Por lo general, los portaobjetos se pueden enjuagar y reutilizar, pero el uso de esmalte de uñas implicara una limpieza con removedor de esmalte si se quiere reutilizarlos.

Tintados

Los tintes sirven para ver mejor ciertos especímenes o microorganismos que de otra forma serían muy difíciles de observar. Entre los tintes más comunes se encuentran el azul de metileno, el yodo o el violeta cristalino.

Para usar el tinte, tanto en muestras húmedas como secas, el procedimiento serà:

1.- Añadimos una pequeña gota en el cubreobjetos antes de cubrir la muestra.

2.- Bajar el cubreobjetos con cuidado y dejar que se mezcle con la muestra por capilaridad.

3.- Con un papel eliminamos el exceso.

Con este proceso le será más fácil localizar las bacterias, parásitos, etc., dentro de la muestra.